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东莞地区痤疮患者痤疮丙酸杆菌耐药基因分析

作者:唐慧菁
  • 作者:唐慧菁
  • 学位授予单位:暨南大学
  • 授予学位:硕士
  • 需要金币:10
  • 添加日期:2019-04-13 14:31
  • 下载地址:无链接信息!
论文介绍及目录
【目的】痤疮是一种慢性炎症性毛囊皮脂腺疾病,好发于青春期,流行病学报道显示,痤疮患病率为60%-90%。痤疮丙酸杆菌(Corynebacterium acnes,C.ances)是痤疮发病的一个重要因素,使用抗生素治疗痤疮成为治疗的主要手段之一,但由此又产生了耐药。本研究旨在通过收集门诊痤疮患者,分离并培养痤疮丙酸杆菌临床株,体外进行临床上常用的11种抗生素药敏性试验,根据药敏结果挑选临床耐药菌株和临床敏感菌株进行高通量基因测序,并与标准株痤疮丙酸杆菌ATCC 6919进行对照,了解本地区痤疮患者痤疮丙酸杆菌耐药基因的情况,从耐药分子机制层面为临床医师用药提供理论依据。【方法】收集符合研究标准的痤疮患者212例,采集、分离痤疮丙酸杆菌,厌氧条件下培养,依靠革兰染色及显微镜初步鉴定细菌形态,使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行菌种鉴定并在体外进行药敏试验。通过琼脂稀释法检测临床分离菌株对大环内酯类、林可酰胺类、四环素类、头孢类、喹诺酮类、硝基咪唑类及磺胺类的最低抑菌浓度,根据药敏及鉴定结果选取大环内酯类-林可酰胺类抗生素高度交叉耐药菌株和敏感菌株共57株,采用十六烷基三甲基溴化铵法(Cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide,CTAB)法提取DNA和琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,随后上机建库进行全基因鸟枪法(WGS)高通量重测序;痤疮丙酸杆菌标准株ATCC 6919采用二代测序Illuminate+三代测序Pac Bio RSII进行全基因组测序。实验数据组装由SMRT Analysis(HGAP3)完成。【结果】1.212例痤疮患者共分离痤疮丙酸杆菌156株,体外药敏结果显示:11种抗生素中除了四环素、多西环素、米诺环素和头孢曲松钠100%敏感以及甲硝唑和复方新诺明100%天然耐药之外,剩余5种抗生素(红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素、左氧氟沙星)均存在着不同程度多重、交叉耐药。耐药情况如下:克拉霉素84.0%(131/156)、阿奇霉素48.7%(76/156)、红霉素30.1%(47/156)、克林霉素28.9%(45/156)、左氧氟沙星5.1%(8/156),其中二重耐药19.4%,三重耐药5.7%,四重耐药28.1%,五重耐药4.3%。2.痤疮丙酸杆菌ATCC 6919(ID:CP023676)的完整基因组由长2,495,001个碱基对的单个环状染色体组成(1个重叠群,N50为13023),GC含量为60.02%,它包含2,450个基因,我们预测和注释了2,437个推定基因,测序深度是100x。我们在CARD数据库中发现ATCC 6919携带thy A抗性基因(ID:08890)。3.57株重测序菌株中,4株敏感株,7株仅对克拉霉素低、中度耐药,6株仅对阿奇霉素低、高度耐药,剩余40株为多重耐药菌株。40株多重耐药菌株中,25%(10/40)在23Sr RNA基因片段2058位点发现由A→G突变,5%(2/40)在23Sr RNA基因片段2058位点发现由A→T突变;65%(26/40)通过CARD和ARDB数据库注释erm X耐药基因阳性;5%(2/40)的高度多重耐药菌未发现携带耐药基因和突变位点。携带erm X耐药基因样品与23Sr RNA基因2058位点发生突变的样品不存在交叉重叠。此外,在40株多重、交叉耐药的痤疮丙酸杆菌中,6株菌株显示五重耐药,83.3%(5/6)通过CARD和ARDB数据库注释gry A耐药基因阳性。【结论】本研究为国内率先采用第二代测序技术对痤疮丙酸杆菌耐药基因进行检测,并对20世纪60年代痤疮丙酸杆菌ATCC 6919进行第二代和第三代全基因测序,测序结果已上传NCBI数据库。本研究标本量较大共57株痤疮丙酸杆菌,采用第二代测序技术检测,耐药结果显示:发现65%多重耐药菌株携带erm X耐药基因,30%在23Sr RNA片段2058位点发现A-G或A-T突变,5%的多重耐药菌株存在未知耐药机制,该耐药机制分配比例符合临床痤疮丙酸杆菌对大环内酯-林可酰胺类抗生素广泛耐药的临床表现。

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